抗体的纯化(硫酸铵沉淀法)
一，基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二，试剂及仪器
1.组织培养上清液、血清样品或腹水等
2.硫酸铵(NH4)SO4
3.饱和硫酸铵溶液(SAS)
4.蒸馏水
5.PBS(含0.2g/L叠氮钠)
6.透析袋
7.超速离心机
8.pH计
9.磁力搅拌器
三，操作步骤
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。
(一)配制饱和硫酸铵溶液(SAS)
1.将767g(NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1mol/L,25°C).
2.其它不同饱和度铵溶液的配制
(二)沉淀
1.样品(如腹水)20000′g离心30min，除去细胞碎片；
2.保留上清液并测量体积；
3.边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1(
4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C)，使蛋白质充分沉淀。
(三)透析
1.蛋白质溶液10000′g离心30min(4°C)。弃上清保留沉淀；
2.将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对
PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时(4°C)，每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；
3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
四，应用提示
(一)先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。
1.边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1(v/v)；
2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C)；3.3000′g离心30min(4°C)，保留上清液；上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；
4.上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；
5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效
(二)为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1)；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 |
